Nel 1734 Carlo di Borbone diviene re di Napoli e decide di trasferire la collezione ereditata dalla madre Elisabetta Farnese nella capitale del suo regno. La raccolta di dipinti, che comprendeva opere rinascimentali di scuola tosco-romana ed alcuni ritratti, fu trasferita nel Palazzo di Capodimonte verso la metà del Settecento. La collezione viene ospitata nelle sale del primo piano della reggia, e accanto alle opere farnesiane sono stati sistemati anche dipinti appartenuti ai Borbone. La raccolta si è poi incrementata grazie a donazioni di privati.
Il museo, dopo anni di restauri, viene ufficialmente inaugurato nel 1957: i dipinti vengono divisi per collezioni storiche, seguendo un ordine cronologico e per scuola.